線粒體復(fù)合體Ⅰ試劑盒說(shuō)明書

微量法

正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義

復(fù)合體Ⅰ（EC 1.6.5. 3）又稱NADH-CoQ 還原酶或NADH脫氫酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，是線粒體內(nèi)膜中大的蛋白復(fù)合物。該酶催化一對(duì)電子從NADH 傳遞給CoQ，同時(shí)可使O2還原生成O2.-，是呼吸電子傳遞鏈上產(chǎn)生O2.-的主要部位。測(cè)定該酶活性，不僅可以反映呼吸電子傳遞鏈（ETC）狀態(tài)，而且可以反映活性氧（ROS）生成狀態(tài)。

測(cè)定原理

復(fù)合體Ⅰ能夠催化NADH脫氫生成 NAD+，在340nm下測(cè)定NADH的氧化速率計(jì)算出該酶活性的大小。

需自備的儀器和用品

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

試劑一：液體 100mL×1 瓶，-20℃保存； 試劑二：液體 20mL×1 瓶，-20℃保存； 試劑三：液體 1.5mL×1 瓶，-20℃保存； 試劑四：液體 25mL×1 瓶，-20℃保存； 試劑五：液體 1mL×1 支，-20℃保存；

試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存，用時(shí)加入2mL蒸餾水，現(xiàn)配現(xiàn)用。工作液的配制：臨用前將試劑五轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解；現(xiàn)配現(xiàn)用；

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

① 準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

② 將勻漿600g，4℃離心 5min。

③ 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

④ 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅰ（此步可選做）。

⑤ 步驟④中的沉淀即為線粒體，加入200uL試劑二和2uL試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％ 或200W，超聲3s，間隔10秒，重復(fù)30次），用于復(fù)合體Ⅰ酶活性測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定

（1） 工作液于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育5min。

（2） 在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、200μL工作液和15μL試劑六，混勻，記

錄340nm處初始吸光值A(chǔ)1和2min 后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

復(fù)合體Ⅰ活力單位的計(jì)算

a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下：

（1） 按蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

復(fù)合體Ⅰ活力（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T

=1808×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

復(fù)合體Ⅰ活力（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W×V樣÷V樣總)

÷T=365×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

復(fù)合體Ⅰ活力(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷

T=0.73×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2.25×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L/mol/cm；d： 比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T： 反應(yīng)時(shí)間，2 min；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)。

b. 使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：

（1） 按蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

復(fù)合體Ⅰ活力（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T

=3616×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

復(fù)合體Ⅰ活力（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總)

÷T=730×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

復(fù)合體Ⅰ活力（nmol/min/104cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)

÷T=1.46×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2.25×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d： 96孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL； T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)。

A549-DDP細(xì)胞培養(yǎng)說(shuō)明書